| T i p s |
| Una publicación en apoyo de los productores de setas |
| Artículo del mes de Agosto de 2005 |
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| Avances en el cultivo de Ganoderma lucidum en México |
| Por Conrado Soto Velazco, Ma. Concepción López y Eduardo Vázquez Valls; reproducido con autorizacion |
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| ACERCA DE LOS AUTORES: INSTITUCION DE RESIDENCIA Laboratorio de Biotecnología. Depto. de Botánica y Zoología. Universidad de Guadalajara. A. P. 139-1, Zapopan, Jalisco, C. P. 45 100, México. Numero telefónico (33) 36-82-00-03 (10-12 horas) Buzones electrónicos de Conrado Soto Velazco: csoto@cucba.udg.mx y conrado@setascultivadas.com |
| Conrado Soto Velazco |
| Figura 1: Resultados de la proliferación de linfocitos humanos en presencia de los extractos de Ganoderma lucidum. |
| RESUMEN Se cultivó a Ganoderma lucidum sobre bagazo de maguey tequilero, con la finalidad de determinar si este substrato funciona para la obtención de carpóforos, los cuales son la materia prima para la obtención de los principios activos con propiedades medicinales. El bagazo de maguey tequilero (BMT) se mezcló con cascarilla de algodón (BMT+CA) o cáscara de cacahuate (BMT+CC) en proporción del 5 % con base en el peso húmedo del bagazo. Se obtuvo la mayor EB en la mezcla de bagazo y cascarilla de algodón con 8.46 % (P>0.01), en segundo lugar con la mezcla con cáscara de cacahuate con 7.84 % y la menor de 5.06 % con bagazo de maguey puro. Con esto se comprobó que es necesario suplementar al bagazo para poder obtener una mejor produccion de carpoforos de Ganoderma lucidum. Los carpóforos cosechados se deshidrataron, se molieron y se cribaron. Con la harina obtenida se prepararon tres tipos de extractos: extracto acuoso, extracto lixiviado y extracto crudo; todos los extractos se concentraron a 1/5 de su volumen original en un rotavapor y se esterilizaron por medio de microfiltración. Con la finalidad de observar el efecto que tienen estos extractos en la proliferación de linfocitos humanos, se obtuvo sangre periférica de 18 individuos en edades de 18 y 45 años. De las muestras se obtuvieron linfocitos y se cultivaron durante 72 h a 37 ºC, después se centrifugaron y se cuantificaron por espectrofotometría; el extracto acuoso incrementa el porcentaje de linfocitos hasta un 600 % , el extracto crudo en un 550 % y el lixiviado 450 %. En los grupos comparativos (de "control") los incrementos fueron del 100 y del 275 %.; de los resultados anteriores se presume que, al cultivar G. lucidum sobre el bagazo de maguey tequilero, no se pierden los principios activos inmunoestimuladores, con lo cual surge la posibilidad de utilizar este bagazo en la produccion comercial de esta especie en México. |
| INTRODUCCION Ganoderma lucidum es un hongo al que se le atribuyen ciertas propiedades curativas en la medicina tradicional de los países asiáticos y se ha utilizado buscando las curas del cáncer, hipertensión, insomnio, bronquitis, enfermedades del corazón, síndrome de fatiga crónica e impotencia sexual, entre otros. Diversos estudios se han encaminado a determinar los principios activos que posee esta especie y su aplicación medicinal. Se han obtenido substancias con actividad biológica entre las que destacan glucanos, proteínas, triterpenos, ácido ganodérico, ergosterol, polinucleótidos, etc. La proteína LZ-8 tiene actividad inmunomoduladora y mitogénica en leucocitos de sangre humana. Actualmente G. lucidum se cultiva en aserrín de diversas maderas duras y se emplea como la materia prima necesaria para la obtención de los extractos. En México recientemente surgió el interés por estos hongos con propiedades medicinales por lo que en diversas instituciones de investigacion se han iniciado trabajos para el aislamiento de cepas nativas de Ganoderma lucidum. Rodríguez y Soto Velazco (1997), Olivares et. al. (2000) y Palacios y Ramirez (2000) determinaron que el medio HIT permite un abundante crecimiento algodonoso del micelio comparado con el medio de extracto de malta con agar y papa con dextrosa y agar. También probaron su crecimiento en granos de sorgo, trigo y mijo para la obtención del inóculo. En el presente estudio se investigó el crecimiento de Ganoderma lucidum en bagazo de maguey tequilero con la finalidad de determinar los parámetros de crecimiento sobre este desecho agroindustrial, el cual es un substrato satisfactorio para cultivar las especies de Pleurotus y Lentinus (Soto Velazco, 1991 y Soto Velazco et al. 1995). Finalmente se obtuvieron extractos crudos de los carpóforos cosechados y se aplicaron a cultivos de linfocitos para observar la influencia de su actividad mitogénica. |
| Al cultivar Ganoderma lucidum sobre el bagazo de maguey tequilero, no pierde los principios activos inmunoestimuladores |
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| MATERIAL Y METODOS Los carpóforos de Ganoderma lucidum fueron recolectados en un bosque de encino del volcan de Tequila, Jalisco, Mexico. La cepa se aisló por medio de cultivo vegetativo en el medio de harina de trigo (10 gr/ l) y agar (1.5%) (Bioxon). La cepa quedó registrada como IBUG-76 y es mantenida en refrigeración en tubos de ensaye con agar inclinado a 4 ºC. El inóculo se elaboró en bolsas de polipropileno con granos de sorgo con 45 % de humedad. El bagazo de maguey tequilero se obtuvo de una fábrica de tequila de la ciudad de Tequila, Jalisco, Mexico. Dicho bagazo se apiló en forma de cordón para fermentarlo aeróbicamente por espacio de 20 días, para eliminar los azúcares residuales que posee una vez que se desecha fuera de la fábrica. El bagazo fermentado (BMT) fué mezclado con cascarilla de algodón (BMT+CA) o cáscara de cacahuate (BMT+CC) en una proporción de 5% con base en el peso húmedo del bagazo. Las mezclas y BMT fueron considerados como tratamientos. Se llenaron bolsas de polipropileno de 15 x 35 cm con 450 g de bagazo suplementado y sin suplementar. Posteriormente se esterilizaron a 121 ºC durante 40 min. La inoculación se realizó 24 horas después. El substrato inoculado se dejó incubar a 28 ºC hasta que lo cubrió el micelio. Los parámetros que se evaluaron fueron el número de días de incubación, la aparición de primordios, el desarrollo de carpóforos y la eficiencia biológica (EB) de acuerdo a Tschierp y Hartman (1977). Se utilizó un diseño completamenete al azar con 10 repeticiones por tratamiento. Para el análisis de resultados se aplicó el método de Anova y la comparación de medias con el método de Tukey. Los carpoforos cosechados se deshidrataron a 50 ºC en una estufa marca Felisa, hasta obtener un peso constante. Se molieron en un molino de cuchillas y se cribaron en un malla del número 20 (1mm). |
| Con la harina obtenida se prepararon tres tipos de extractos (5g/100 ml de solvente) de acuerdo a lo siguiente: extracto acuoso (EA) agua destilada con agitación y a temperatura ambiente durante 60 m; extracto lixiviado (EL) agua destilada a 80-85 ºC con agitación y durante 60 m; extracto crudo (EC) con una mezcla de cloroformo-metanol (9:1) en un equipo Soxlet durante 30 m. Todos los extractos se concentraron a 1/5 de su volumen original en un rotavapor. Posteriormente se esterilizaron por medio de filtracion (Millipore 2 micrómetros). Con la finalidad de observar el efecto que tienen estos extractos en la proliferación de linfocitos humanos, se obtuvo sangre periférica de 18 individuos de 18 hasta 45 años. De las muestras de sangre se obtuvieron linfocitos por gradiente de densidad y con lavados de un amortiguador de fosfato (PBS) y 1500 rpm. La viabilidad celular se midió con azul tripano bajo un microscopio óptico. El cultivo de los linfocitos se realizó en tubos cónicos de 15 ml a los que se les agregó 5 ml de RPMI 1640 (Sigma R-6504), 500 ml de suero fetal bovino (Sigma F-4135) y 200 mm de fitohemaglutinina en una concentración final de 5 mg por cultivo (GIBCO 10576-015), 2 millones de linfocitos y 100 ml de cada uno de los extractos probados. Las células se cultivaron durante 72 h a 37 ºC, con una humedad relativa del 95 % en una estufa marca VIP CO2 Incubator 417 Lab-line Instruments, Inc. La proliferación celular se midió por medio de espectrofotometría marcando las celulas con sal de tetrazolium (MTT), el cual se une en la mitocondria activa de las células vivas. A cada tubo de cultivo se le adicionó 500 ml de MTT y se incubaron durante 4 horas a 37 ºC. Después se centrifugaron durante 10 minutos y 1500 rpm. El sobrenadante se desechó y a cada tubo se le adicionó 1 ml de isopropanol (0.040 N HCl). La lectura se realizó en 570 nm en un espetrofotómetro marca Metrolab 330. Los resultados se analizaron por el metodo Anova y T de Student (a =0.05). |
| RESULTADOS Y DISCUSIÓN El micelio de Ganoderma lucidum tuvo un buen crecimiento en el bagazo de maguey tequilero, el cual cubrió alrededor de los 15 días en BMT, 22-23 en BMT+CA y 18-19 días en BMT+CC. Sin embargo la aparición de primordios fué hasta los 63, 69 y 70 días respectivamente. La cosecha de los carpóforos se realizó una vez que el píleo alcanzó su máximo tamaño de expansión y fué a los 76 días en BMT, 92 en BMT+CA y de 88 en BMT+CC . En la tabla 1 se señalan las EB obtenidas en cada uno de los substratos. Como se observa se obtuvo la EB más alta en la mezcla de bagazo y cascarilla de algodón con 8.46 % (P>0.01), en segundo lugar se obtuvo la mezcla con cáscara de cacahuate con 7.84 % y de 5.06 % con bagazo de maguey puro. Con esto se comprobó que es necesario suplementar al bagazo para poder obtener una mejor producción de carpóforos de Ganoderma lucidum. |
| Formula sustrato Dias de incubacion Dias a la primera oleada Eficiencia biologica (%) BMT 15 63 5.06 ±0.3 c BMT+CC 18-19 69 7.84 ±0.4 ab BMT+CA 22-23 70 8.46 ±0.30 a Las letras indican diferencias significativas (Tukey, P>0.01) |
| Como se puede observar en la figura, se encontró que el extracto acuoso incrementa el porcentaje de linfocitos hasta un 600 % , el extracto crudo un 550 % y el lixiviado 450 %. En cambio en los grupos controles como el RPMI tuvo 100 % y en la fitohemaglutinina incrementó en 275 %. Dichos resultados estan de acuerdo con los que presentaron Byong-Ka et al. (1997), que encontraron un efecto en la proliferación de leucocitos humanos en presencia de extractos metanólicos comparados con agentes inmunosupresores e inmunoestimuladores. Se encontraron diferencias notables en la proliferación de los grupos controles y los extractos de Ganoderma lucidum (P>.0.01) por lo que suponemos que al cultivar esta especie en el bagazo de maguey tequilero se conservan los principios activos inmunoestimuladores y podría utilizarse el bagazo mencionado en la producción comercial de dicho hongo en México. Por otra parte se demuestra que los ejemplares silvestres de Ganoderma lucidum nativos de México también poseen sustancias inmunomoduladoras y podrían compararse las cepas provenientes del oriente con las cepas mexicanas. |
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| Tabla 1: Parámetros evaluados durante el cultivo de Ganoderma lucidum en bagazo de maguey tequilero. |
| Las cepas de Ganoderma lucidum procedentes de ejemplares silvestres mexicanos también poseen sustancias inmunomoduladoras |
| En México hay interés por los hongos con propiedades medicinales, por lo que en diversas instituciones de investigacion se están aislando cepas mexicanas de Ganoderma lucidum |
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| Ejemplares de Ganoderma lucidum cultivados empleando como sustrato el bagazo del maguey tequilero |
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